Determinación indirecta de gluten mediante métodos basados en la detección de ADNPCR y genosensores electroquímicos

Résumé

La enfermedad celíaca es una enteropatía autoinmune muy frecuente, que se produce en individuos genéticamente predispuestos como resultado de una respuesta inmune exacerbada contra el gluten. El único tratamiento es evitar el consumo de alimentos que contengan gluten. Por esto, la identificación de la presencia de gluten y su cuantificación son de primordial importancia, a la vez que un reto, debido a la dificultad de su análisis. La verificación analítica del cumplimiento de los requisitos de etiquetado y de detección de trigo en los productos alimenticios se realiza principalmente por la detección de proteínas mediante enzimoinmunoensayo, ELISA. Sin embargo, algunas de sus limitaciones han propiciado el desarrollo de tecnologías alternativas. Así, los métodos basados en el ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, la PCR en tiempo real o los sensores de ADN, también denominados genosensores, son opciones atractivas. Todos ellos comparten dos ventajas: el analito en sí se amplifica y, por lo tanto, se pueden detectar cantidades muy bajas del mismo, y son métodos muy convenientes para alimentos procesados debido a la mayor estabilidad del ADN, en comparación con las proteínas. Por ello, en la última década han surgido métodos de PCR y PCR en tiempo real para la detección de trigo en alimentos, aunque la mayoría no alcanzan la sensibilidad necesaria. Los genosensores, en especial los electroquímicos, son una alternativa simple, barata y portátil para la detección de ADN, y con posibilidad de miniaturización. Aun así, su aplicación para la detección de trigo en alimentos está sin explotar. La Tesis Doctoral se centra en la detección indirecta de gluten empleando secuencias de ADN específicas de cereales dañinos para enfermos celiacos. Se realizó una búsqueda de las secuencias de ADN relacionadas con los cereales tóxicos para los enfermos celíacos adecuadas para emplearlas como analito. Se caracterizó ampliamente el comportamiento de tres secuencias de ADN por PCR en tiempo real, obteniéndose con todas ellas una excelente sensibilidad, por debajo de 20 ppm, cumpliendo con los requisitos impuestos por la legislación vigente. Se constató una fuerte influencia de la matriz en los resultados obtenidos, por lo que se hace necesario adecuar la matriz de los patrones a la de la muestra para evitar desviaciones al valor verdadero. La secuencia de ADN que codifica el péptido inmunodominante de la gliadina fue la que generó los mejores resultados, motivo por el cual se diseñó un genosensor electroquímico para su detección, el primero específicamente diseñado para el análisis de gluten. Al contrario que para el caso de otros genosensores electroquímicos, la detección de fragmentos amplificados por PCR de muestras reales se pudo realizar sin ningún tipo de purificación previa de los amplicones y permitió cuantificar 15 pg de ADN de trigo o 10 ppm de trigo en matriz de arroz, una detectabilidad que rivaliza con los métodos más sensibles de PCR en tiempo real. El genosensor permitió la determinación de ADN de todos los cereales tóxicos incluida la avena, y no mostró reactividad cruzada con otras especies seguras como arroz y soja. Para disponer de un método específico de trigo, la selectividad del sensor fue modificada mediante el uso de sondas estructuradas que permitieron la detección selectiva de trigo frente a otros cereales filogenéticamente relacionados, sin comprometer en gran medida las características analíticas del genosensor. Por último se exploró el método de análisis de curvas de disociación de alta resolución, HRM, pudiéndose discriminar el tipo de cereal del que proviene el gluten presente en una muestra. En definitiva, los métodos propuestos en este trabajo, una vez caracterizados y optimizados, suponen un avance en la detección de gluten a través de secuencias de ADN específicas de trigo y constituyen sistemas pioneros en un campo que está aún por explorar, pero que tiene enormes posibilidades de desarrollo.