Taxonomía de levaduras de origen enológico por espectrometría de masas

Resumen

Esencialmente, la tesis presentada bajo el título ¿Taxonomía de levaduras de origen enológico por espectrometría de masas¿ trata sobre la implementación del proceso de identificación y clasificación taxonómica de levaduras de interés enológico mediante el empleo de la técnica MALDI TOF MS, como alternativa a la utilización de técnicas clásicas y moleculares. Se ha creado una librería de espectros de masas mediante MALDI TOF MS con una extensa colección de levaduras aisladas del entorno enológico. Debido a la importancia en enología de las propiedades a nivel de cepa de las levaduras, el estudio se ha realizado a distintos niveles de complejidad taxonómica, abordando la diferenciación de levaduras por esta técnica a los niveles de género, especie y cepa. Las levaduras en estudio se han aislado durante las vendimias de los años 2011 a 2014 en bodegas pertenecientes a tres Denominaciones de Origen: Ribera de Duero, Rueda y Tierra de León. En total se han realizado 1665 aislamientos correspondientes a dos grandes grupos, Saccharomyces y no Saccharomyces, de los cuales se han seleccionado 216 para el análisis por espectrometría de masas, 98 cepas de S. cerevisiae y 118 cepas pertenecientes a especies no Saccharomyces. Las levaduras seleccionadas han sido identificadas previamente por técnicas clásicas y moleculares basadas en el ADN. En el caso de S. cerevisiae se ha realizado la diferenciación a nivel de cepa mediante la amplificación por PCR de los polimorfismos de la región interdelta, y para las especies de no Saccharomyces se ha empleado la secuenciación de una región del ADNr 26S. El equipo empleado para el análisis ha sido un espectrómetro de masas MALDI TOF, modelo Ultraflex II LIFT de Bruker. La optimización del proceso de preparación de muestra consistió esencialmente en la preparación de los extractos de proteínas de las levaduras. Se han optimizado los parámetros más importantes, incluyendo cultivo de las levaduras, tipo de placa MALDI, tipo de matriz, así como otros parámetros implicados en la técnica para obtener espectros de masas de forma sencilla y reproducible. Para la creación de la librería de espectros de masas sintéticos, cada espectro de masas ha sido procesado con un programa estadístico programado en R mediante el empleo de un paquete desarrollado para la identificación de los iones representativos de cada espectro de masas en forma de líneas, las cuales se detectan en un margen de relación señal ruido (SNR) de 20 a 5. El procedimiento aplicado en la selección de los iones representativos ha consistido en disminuir progresivamente la SNR hasta detectar un mínimo de 20 líneas o hasta que la SNR descendía hasta un valor de 5. Cada uno de los espectros de masas sintéticos correspondientes a cada cepa de levadura se ha generado a través de un programa desarrollado en lenguaje FORTRAN, a partir del análisis por triplicado de cada cepa de levadura. La diferenciación e identificación de las especies M. fructicola y M. pulcherrima (que no estaban claramente diferenciadas mediante técnicas biológicas clásicas y moleculares) ha sido posible mediante análisis de varias cepas de cada especie empleando MALDI TOF MS, y comparando con cepas Tipo procedentes de colecciones internacionales de cultivos. Al comparar los espectros de masas de cada una de las cepas analizadas con los espectros de masas de las cepas tipo de M. fructicola y M. pulcherrima, se ha comprobado que la identificación asignada para cada especie mediante técnicas clásicas y moleculares no se corresponde con la identificación mediante MALDI TOF MS, ofreciendo una asignación cruzada. A diferencia de las técnicas clásicas y moleculares, la técnica MALDI TOF MS permite la diferenciación rápida y precisa, en concreto, de estas dos especies, evitando las identificaciones erróneas asignadas por la técnica de secuenciación del ADNr 26S.