Individual and mixture toxicity of pharmaceuticals towards microalgae. Role of intracellular free Ca2+

Resumen

Millones de toneladas de productos químicos son producidos anualmente en el mundo. Muchos de estos químicos son empleados en nuestro día a día y acaban alcanzando las aguas superficiales. Los químicos que llegan a las aguas superficiales y no sé encuentran legislados se denominan contaminantes emergentes. En el capítulo 1 se describe la problemática de los contaminantes emergentes y los bioensayos que se utilizan con el fin de evaluar su efecto sobre los ecosistemas, así como los métodos empleados para el estudio de mezclas de contaminantes. Entre los contaminantes emergentes se encuentran los fármacos, los cuales son utilizados para salvaguardar la salud humana y animal. Su elevado consumo y relativamente baja tasa de eliminación en las plantas de tratamiento de aguas residuales provocan su entrada en las aguas superficiales. Entre los fármacos destacan los antibióticos que han sido empleado de forma generalizada en las últimas décadas por la industria alimentaria, además de para fines humanos, provocando su entrada masiva en las aguas superficiales. En las aguas superficiales de todo el mundo se encuentran un gran número de contaminantes emergentes a concentraciones que van desde ng/L a μg/L. Por tanto, los organismos que habitan estos ecosistemas están expuestos a ellos. Las algas y cianobacterias, productores primarios de los ecosistemas acuáticos, juegan un papel clave en el ciclo del carbono y el nitrógeno (en el caso de las cianobacterias fijadoras de nitrógeno) y pueden verse afectados por los contaminantes emergentes, lo cual desencadenaría daños en el funcionamiento global del ecosistema. Mientras que las concentraciones individuales de los contaminantes emergentes son relativamente bajas, causando efectos limitados, las mezclas de estos contaminantes pueden encontrarse en concentraciones de μg/L y resultar en una toxicidad significativa. Los componentes de las mezclas puede no interaccionar o interaccionar, sinérgica o antagónicamente. Por tanto, las mezclas de contaminantes emergentes pueden tener un efecto tóxico sobre los ecosistemas mayor al esperado de la suma de sus efectos individuales. El objetivo principal de esta tesis es estudiar los efectos biológicos de los contaminantes emergentes, poniendo especial hincapié en los productos farmacéuticos, sobremicroorganismos fotosintéticos acuáticos de gran relevancia ecológica, entre ellos algas verdes y cianobacterias. El objetivo principal de los capítulos 2 y 3 de esta tesis es evaluar el riesgo potencial para el medioambiente de las mezclas de contaminantes emergentes, investigando las interacciones que se producen entre ellos y desarrollando nuevas herramientas que permitan reconocer que contaminantes emergentes son los principales responsables de los efectos tóxicos observados en mezclas complejas a concentraciones reales. Para este fin se emplearan los organismos fotosintéticos de gran relevancia ecológica: Pseudokirchneriella subcapitata, un alga verde unicelular en la que se estudió la toxicidad en base a la inhibición de la fluorescencia de la clorofila, y Anabaena sp. PCC7120 CBP4337, una cianobacteria recombinante bioluminiscente en la que se estudió la toxicidad en base a la inhibición de su bioluminiscencia constitutiva reflejo de su actividad metabólica; así como biopelículas de comunidades microbianas de ríos. En el capítulo 2, con el fin de evaluar el riesgo potencial para el medioambiente de las mezclas de contaminantes emergentes e investigar las interacciones que se producen entre ellos, se estudió la toxicidad individual y en mezcla de cinco antibióticos (amoxicilina, eritromicina, levofloxacino, norfloxacino y tetraciclina), que habitualmente se encuentran en aguas superficiales, sobre los dos organismos fotosintéticos: una cianobacteria (Anabaena sp. PCC7120 CBP4337) y un alga verde (Pseudokirchneriella subcapitata). Los resultados obtenidos muestran que la eritromicina es el antibiótico más tóxico para ambas. Por lo general, la cianobacteria fue más sensible, probablemente debido a su naturaleza procariotica, que el alga verde; la amoxicilina no causó efectos tóxicos sobre el alga verde. Se estudiaron las interacciones toxicológicas producidas por las mezclas de antibióticos utilizando el método del “Combination Index”, el cual permite determinar y cuantificar la naturaleza de la interacción, sinérgica o antagónica, de los componentes de una mezcla a todos los niveles de efecto, independientemente de cual sea su número y su mecanismo de acción, teniendo en cuenta la potencia y la forma de la curva dosis-respuesta de cada uno de ellos. Se encontraron predominantemente interacciones sinérgicas en las mezclas binarias y complejas de los antibióticos en ambos organismos. Cabe destacar que el antibiótico tetraciclina interactuó sinérgicamente con los otros antibióticos en casi todas las mezclas en las que se encontraba presente. Con el fin de evaluar qué método predecía mejor las interacciones toxicologías observadas en las mezclas de antibióticos se compararon los resultados obtenidos utilizando el método del “Combination Index” con otros dos métodos ampliamente empleados en toxicología de mezclas, “Concentration addition”, basado en el supuesto de que todos los componentes de la mezcla tienen un mecanismos de acción similar, e “Independent action”, basado en el supuesto de que todos los componentes de la mezcla tiene distinto mecanismo de acción. El método del “Combination Index” fue el que ofreció una mejor predicción de la toxicidad de las mezclas de antibióticos. Utilizando los resultados toxicológicos obtenidos de los antibióticos individuales y en mezclas, se realizó una evaluación de riesgo ambiental estudiando si las concentraciones de antibióticos presentes en las aguas superficiales podían producir efectos negativos sobre los dos organismos fotosintéticos. Los resultados muestran que las concentraciones que aparecen en las aguas superficiales de eritromicina y de la mezcla eritromicina y tetraciclina, la cual fue fuertemente sinérgica a bajos niveles de efecto, podrían dañar a microrganismos acuáticos productores primarios, como las cianobacterias y las algas verdes. Las contaminantes emergentes aparecen en las aguas superficiales en mezclas complejas, a bajas concentraciones y con la capacidad de interaccionar entre sí y con otros factores abióticos de forma lineal y no lineal. Para evaluar los efectos de las mezclas complejas a concentraciones reales de contaminantes emergentes es necesario desarrollar nuevas herramientas que nos permitan encontrar cuales son los principales contaminantes responsables de la toxicidad de las mezclas. En el capítulo 3, se desarrolló una nueva herramienta que permite reconocer que contaminantes emergentes son los principales responsables de los efectos tóxicos observados en mezclas complejas a concentraciones reales. La herramienta se baso en el empleo del método de Morris, un Análisis de Sensibilidad Global, acoplado con un cribado de alto rendimiento, basado en un bioensayo de inhibición de la bioluminiscencia por efecto tóxico (utilizando Anabaena sp. PCC7120 CBP4337) con alto número de réplicas usando placas de 96 pocillos totalmente aleatorizadas. Para evaluar el efecto de las mezclas complejas a concentraciones reales de contaminantes emergentes la cianobacteria Anabaena sp. PCC7120 CBP4337 fue expuesta a mezclas de 16 fármacos, a tres niveles de concentraciones representativos de las aguas superficiales, y un factor abiótico (intensidad de luz) de forma individual y en mezclas (un total de 180 mezclas diferentes). Los resultaron mostraron que 67 de las 180 mezclas causaron un efecto tóxico sobre la cianobacteria. Para estudiar si los modelos actuales permiten predecir la toxicidad de mezclas complejas a concentraciones reales se compararon los resultados obtenidos de los efectos tóxicos de las mezclas complejas a concentraciones reales de los 16 fármacos y un factor ambiental con la predicción del método del “Concentration addition”. Los resultados mostraron que el “Concentration addition” únicamente fue capaz de explicar entre 0 y el 0.026 % del efecto observado en las mezclas. Por otro lado, el método de Morris acoplado al un cribado de alto rendimiento utilizando Anabaena sp. PCC7120 CBP4337 fue capaz de identificar los principales contaminantes responsables de la toxicidad de mezclas complejas a concentraciones reales proporcionando una clasificación cualitativa de los mismos basada en su efecto e interacción. Los fármacos carbamazepina (antiepiléptico), furosemida (diurético), eritromicina (antibiótico), hidroclorotiazida (diurético), gemfibrozil (regulador lipídico), venlafaxina (antidepresivo), atenolol (beta bloqueantes) y diclofenaco (analgésico) fueron identificados como los principales responsables de la toxicidad en las 180 mezclas. Para evaluar los resultados obtenidos del método de Morris y estudiar si dichos resultados eran extrapolables a niveles superiores a población se expuso a comunidades complejas microbianas de aguas superficiales (biopelículas de río) a: la mezcla más tóxica, la mezcla más tóxica diluida 10 veces y la mezcla más tóxica sin los cuatro principales contaminantes responsables de la toxicidad. Los resultados muestran que la mezcla más tóxica sin los cuatro principales contaminantes responsables de la toxicidad evolucionó de igual forma que el control a lo largo del tiempo (no mostró toxicidad significativa respecto al control no tratado), mientras la mezcla más toxica y la mezcla más toxica diluida 10 veces evolucionaron de forma diferente al control (mostrando toxicidad significativa respecto al mismo). Por tanto, la eliminación de los cuatro principales contaminantes responsables de la toxicidad fue más efectiva en prevenir la toxicidad de la mezcla que diluirla 10 veces. Los resultados confirmaron que el método de Morris es capaz de encontrar los principales contaminantes responsables de la toxicidad de las mezclas complejas a concentraciones reales. Para evaluar el efecto de los contaminantes emergentes sobre los organismos acuáticos se emplean bioensayos de toxicidad y también de exposición. Los bioensayos basados en biomarcadores de exposición proporcionan información sobre la percepción de ciertos contaminantes por parte de los organismos de una forma rápida y reproducible. El Ca2+ libre intracelular, [Ca2+]i, es un segundo mensajero que está involucrado en la percepción y señalización de un gran número de estreses abióticos, incluidos los contaminantes. El objetivo principal de los capítulos 4 y 5 de esta tesis es evaluar si el [Ca2+]i puede ser utilizado como un biomarcador de exposición a contaminantes emergentes de forma individual y en mezclas, así como estudiar el papel del [Ca2+]i en la respuesta celular global a contaminantes emergentes. Para estudiar el papel del [Ca2+]i como biomarcador de exposición a contaminantes se empleó la cianobacteria recombinante Anabaena sp. PCC7120 pBG2001a, la cual expresa constitutivamente la apoecuorina, una proteína indicadora de unión a Ca2+ que permite medir de forma continua e in vivo el [Ca2+]i. Para estudiar el papel del [Ca2+]i en la respuesta celular provocada por contaminantes emergentes se utilizó el alga verde Chlamydomonas reinhardtii. En el capítulo 4, con el fin de evaluar el uso del [Ca2+]i como un biomarcador de exposición a contaminantes emergentes en organismos de relevancia ecológica, se expuso a la cianobacteria Anabaena sp. PCC7120 pBG2001a a los cinco antibióticos (amoxicilina, eritromicina, levofloxacino, norfloxacino y tetraciclina) individualmente y en mezclas, cuya toxicidad individual e interacciones toxicológicas en mezclas había sido previamente investigadas en el capítulo 2 de esta tesis usando Anabaena sp. PCC7120 CBP4337. Los resultados obtenidos muestran que los cinco antibióticos indujeron un rápido cambio (2-3 segundos) en el [Ca2+]i, dependiente de la concentración y diferente para cada uno de los antibióticos, por tanto, indujeron lo que se denomina “firmas de Ca2+” específicas (una combinación concreta de cambios en [Ca2+]i). Los resultados sugieren que el [Ca2+]i puede ser empleado como un buen biomarcador de exposición a antibióticos. Respecto a las mezclas, se registraron los cambios producidos en el [Ca2+]i en respuesta a mezclas binarias y complejas de los antibióticos. Al comparar los resultados con los obtenido previamente, de las interacciones toxicológicas usando Anabaena sp. PCC7120 CBP4337 (capítulo 2), determinamos que la naturaleza de las interacciones toxicológicas, antagónicas y sinérgicas, de mezclas binarias y compleja de antibióticos podían ser predichas usando el biomarcador temprano de exposición [Ca2+]i, antes de que el efecto tóxico se produzca. El [Ca2+]i puede ser considerado un biomarcador temprano de la exposición a contaminantes, pero es importante conocer los mecanismos que utiliza la célula para responder a los contaminantes y qué papel desempeña el [Ca2+]i en ello. En el capítulo 5, con el fin de evaluar el papel del [Ca2+]i en la respuesta celular provocada por un contaminante emergente en organismos de relevancia ecológica, estudiamos el papel del [Ca2+]i en la respuesta celular del alga verde Chlamydomonas reinhardti utilizando un contaminante emergente modelo, el antimicrobiano triclosan. Para estudiar la respuesta celular se emplearon principalmente distintos fluorocromos indicadores de respuestas celulares usando la técnica de citometría de flujo así como medidas fotosintéticas y de expresión génica. El triclosan indujo cambios significativos en la homeostasis del [Ca2+]i y una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (EROs), lo cual condujo a estrés oxidativo, pérdida de la integridad de membrana citoplasmática, despolarización de la membrana citoplasmática, reducción de la actividad metabólica, acidificación del pH intracelular, inhibición de la fotosíntesis, despolarización de la membrana mitocondrial y apoptosis. Para investigar el papel del [Ca2+]i en la respuesta celular tras la exposición a triclosan se empleó el BAPTA-AM, un quelante intracelular de Ca2+ que al querlarlo evita los cambios en [Ca2+]i así, sin señal de [Ca2+]i, se puede estudiar si la respuesta celular al tóxico depende total o parcialmente del [Ca2+]i. La preincubación con BAPTA-AM previno los efectos tóxicos del triclosan sobre la mayoría de los distintos parámetros de respuesta celular estudiados. Por tanto, se ha demostrado que el [Ca2+]i tiene un papel clave en las respuestas celulares desencadenadas por el triclosan y probablemente por otros contaminantes. Hay una controversia importante en la literatura sobre si, una vez se ha producido la exposición al contaminante, los cambios en [Ca2+]i dan lugar a la formación de EROs ó si la formación de EROs es la primera respuesta celular a la exposición al contaminante y el [Ca2+]i sería una respuesta posterior en la cascada de señalización celular, por ello se empleó el NAC (un antioxidante) para estudiar el papel de los EROs en las respuestas celulares tras la exposición al triclosan. Su uso demostró que existe una relación bidireccional entre el [Ca2+]i y la formación de EROs en la respuesta de Chlamydomonas reinhardti tras la exposición a contaminantes emergente como el triclosan. En conclusión, los antibióticos a las concentraciones que aparecen en las aguas superficiales interaccionan entre si pudiendo causar efectos tóxicos mayores a los esperados de la suma de sus efectos tóxicos individuales sobre organismos fotosintéticos. El método de Morris acoplado a un cribado de alto rendimiento es capaz de identificar los principales contaminantes responsables de la toxicidad de mezclas complejas a concentraciones reales. El [Ca2+]i es un buen biomarcador de exposición a antibióticos y es capaz de identificar la naturaleza de sus interacciones toxicológicas de forma temprana. El [Ca2+]i juega un papel clave en la respuesta celular global al triclosan.