Impact of emergent pollutants and multi-stress in "Chironomus riparius"a molecular and cellular analysis

Résumé

En los últimos años se ha observado un fuerte aumento en la fabricación de nuevos productos de consumo, incrementando el número de residuos y, por tanto, la dificultad para gestionarlos correctamente. Entre estos nuevos compuestos se encuentran los denominados contaminantes emergentes (CEs), definidos como productos químicos sintéticos o de origen natural, no legislados y cuyos efectos sobre el medio ambiente y la salud humana son desconocidos. Por tanto, presentan un doble riesgo. Debido a la ausencia de legislación específica para su uso y eliminación, son devueltos al medio ambiente en su estado inicial de modo que se encuentran fácilmente en múltiples compartimentos medioambientales como las aguas superficiales. Por otro lado, se ha demostrado que debido a sus propiedades químicas son persistentes, manteniéndose durante años en el medio ambiente y con capacidad de unirse a los tejidos de los organismos y, por tanto, ser transmitidos a lo largo de la cadena alimentaria. El peligro de estos CEs es que pueden generar daños a concentraciones bajas mediante exposiciones crónicas y, en muchos casos, dichos efectos no se detectan hasta estadios finales de desarrollo. Por ello, pueden ser erróneamente catalogados como inocuos si solo se evalúan parámetros como la supervivencia o la reproducción. En el contexto actual estos compuestos no se encuentran de forma individual en el medio, sino que en la mayoría de casos se presentan en forma de mezclas, tanto de compuestos de la misma naturaleza como de diferente origen. Este escenario aumenta la complejidad de los análisis, así como los posibles efectos en el medio y en los organismos. Además de las propias mezclas, los factores físicos como el pH, la temperatura o la humedad pueden alterar el comportamiento, tanto de los organismos como de los propios xenobióticos. Esta tesis se centra en evaluar los efectos moleculares de la exposición a diferentes xenobióticos, de forma individual o combinada, en larvas acuáticas de cuarto estadio del insecto Chironomus riparius. Se estudiaron varios compuestos de diferente naturaleza química y catalogados como CEs como representantes de los filtros ultravioleta (OD-PABA, OC, BP-3), los fármacos (ibuprofeno), los plastificantes (BPA) y los pesticidas (endosulfan). Además, se analizaron el perfil transcripcional y los biomarcadores bioquímicos en respuesta a la exposición a microplásticos, ya que es una clase de contaminante emergente con un impacto creciente en el medio ambiente. Para ello se ha utilizado la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, diseñando un panel de genes específico para C. riparius. Este panel incluye genes implicados en cinco rutas esenciales para los invertebrados como son el sistema endocrino, la respuesta de detoxificación, la respuesta al estrés, el sistema immune y los mecanismos de reparación del ADN. Los resultados obtenidos han confirmado la utilidad del panel diseñado para evaluar compuestos de diferente naturaleza química ya que todas las rutas se han alterado en mayor o menor medida por cada compuesto. Referente a las mezclas empleadas, se ha observado una mayor toxicidad respecto a la exposición simple de los compuestos, siendo mayor incluso utilizando compuestos de diferente origen (Filtros ultravioleta + BPA). Además, se ha observado un mayor efecto en las exposiciones más largas a pesar del escaso efecto a tiempos cortos, lo que sugiere la necesidad de evaluar varios tiempos. En el caso del BP-3 y temperatura, en general se observó un fuerte efecto sobre la supervivencia con el aumento de temperatura, además la temperatura parece modular la toxicidad de BP-3 en las distintas vías evaluadas e incluso disminuyendo la actividad de fenoloxidasa. Por lo tanto, los resultados enfatizan la importancia de los factores físicos sobre la toxicidad de los contaminantes, así como la diferente respuesta según el tiempo de exposición. El pesticida endosulfan mostró una fuerte disrupción de todas las rutas evaluadas, así como a nivel de actividad enzimática. Este resultado confirma su peligro y sus posibles efectos en la población a largo plazo, a pesar de las bajas concentraciones utilizadas. El ibuprofeno modificó la supervivencia en C. riparius en todas las concentraciones empleadas, detectándose una fuerte mortalidad en las concentraciones más bajas, lo que indica que C. riparius parece ser mucho más sensible a este compuesto que otros invertebrados. A nivel molecular, el ibuprofeno parece producir daño mediante estrés oxidativo alterando el sistema endocrino, la respuesta al estrés y el sistema inmune, pero sin efecto en los mecanismos de detoxificación. Sin embargo, conviene tener presente que los efectos varían de acuerdo al tiempo de exposición empleado. Por último, los microplásticos de polietileno de baja densidad alteraron tanto a la respuesta bioquímica como la respuesta celular. En general las partículas de 32-45 μm presentaron una mayor toxicidad. De forma similar al ibuprofeno, estas partículas parecen producir toxicidad en C. riparius mediante la liberación de especies reactivas de oxígeno y, por tanto, produciendo estrés oxidativo. El aumento de la actividad de la catalasa y el glutatión transferasa, así como la cantidad total de glutatión reducido, respaldan este mecanismo. A nivel transcripcional se produce un fuerte efecto en el sistema endocrino, el sistema inmune y en los genes relacionados con la reparación del ADN, por lo que es posible que se produzca cierta genotoxicidad. Sin embargo, debe dilucidarse si los efectos de estos microplásticos se deben a alteraciones mecánicas debidas a su forma y tamaño o por la liberación de alguno de los componentes que los forman. La presente tesis ha tratado de abordar dos de los problemas medioambientales actuales más relevantes. Por un lado, utilizar una metodología que sirva para poder detectar daños en exposiciones cortas y a nivel molecular, pudiendo servir como señales de alarma y fuente de posibles futuros biomarcadores. Por otro lado, comprobar la efectividad del panel diseñado frente a compuestos de diversa naturaleza química, así como en situaciones de multi-estrés utilizando diferentes escenarios. El panel de genes ha demostrado la relevancia del análisis simultáneo de diferentes rutas, lo que complementa el interés creciente de la comunidad científica por expandir la base de la OECD que describe las denominadas rutas de resultado adversos (AOP). Esta tesis ha resaltado la necesidad de mejorar los test de toxicidad incluyendo las variables moleculares y celulares y diversificando las condiciones del test, como el multi-estrés. Además, mimetizando las condiciones ambientales y añadiendo complejidad al análisis se ha demostrado la generación de interacciones aleatorias y propiedades que no se observan en exposiciones simples.