Estrategias analíticas para la determinación de flavan-3-oles y sus principales catabolitos en diferentes matrices

Resum

Los compuestos polifenólicos son sustancias químicas a las que el ser humano tiene acceso a través de la alimentación. Al ser metabolitos secundarios de las plantas y estar ampliamente distribuidos en el reino vegetal, constituyen parte integral de nuestra dieta mediante el consumo de alimentos de origen vegetal, tales como cereales, legumbres, frutas y verduras. Asimismo, bebidas populares como zumos de fruta, té, café, cacao, cerveza y vino, son otra fuente habitual de polifenoles en nuestra ingesta diaria. El interés de estas sustancias se centra en los efectos positivos que tienen en la salud. Actualmente ha quedado demostrado la relación estrecha entre los alimentos de origen vegetal y la prevención de algunas enfermedades. De entre el gran número de compuestos fenólicos que existen, los flavonoides ocupan el grupo más importante debido a su abundancia, diversidad y propiedades antioxidantes, considerándose como compuestos bioactivos que actúan como agentes terapéuticos en diferentes problemas de salud, destacando entre ellos los flavan-3-oles. El gran interés en conocer la biodisponibilidad y entender el metabolismo de estos compuestos fenólicos, ha motivado el desarrollo de nuevos métodos y estrategias de análisis. La presencia de catabolitos de estos compuestos en los fluidos biológicos permite utilizarlos como indicadores biológicos directos de la entrada de flavanoles en el organismo e indirecto de los demás flavonoides. Diversos estudios han demostrado que algunos de estos catabolitos, son biomarcadores sensibles y fiables de los niveles de flavonoides consumidos en la dieta, utilizándose para asignar niveles de ingesta de determinados polifenoles individuales, en circunstancias en las cuales es complicado medir directamente dicho polifenol. Las muestras biológicas son matrices complejas, con baja concentración de los compuestos de interés, además en la mayoría de los casos, las muestras deben ser tratadas previamente a fin de eliminar los compuestos endógenos de la matriz (interferentes), y/o concentrar la muestra, para su cuantificación y determinación. Esta determinación y cuantificación, en el caso de los catabolitos de flavan-3-oles, se hace complicada por la gran diversidad de compuestos fenólicos que existen y la amplia metabolización que experimentan en el organismo. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo general el desarrollo de nuevos procedimientos y estrategias analíticas, para la determinación de flavan-3-oles y sus principales catabolitos (biomarcadores) en orina. Este trabajo de investigación propone diferentes estrategias de análisis, rápidas, simples, fiables y económicas, desarrollando una metodología adecuada para cuantificar los biomarcadores propuestos en la orina, mediante técnicas quimiométricas, técnicas de impresión molecular y técnicas electroquímicas. Utilizando técnicas quimiométricas (PLS y PARAFAC) se han determinado simultáneamente tres catabolitos fluorescentes (ácido 3-hidroxifenilacético, 4-hidroxifenilacético y siríngico), catabolito de los flavan-3-oles en orina. El método optimizado obtiene recuperaciones de entre 85 y 93%. Además, muestra gran sensibilidad y selectividad con LOD entre 39 y 53 μg/L. El procedimiento propuesto constituye una poderosa herramienta de investigación de la abundancia de estos compuestos en los alimentos ingeridos en la dieta. Técnicas de impresión molecular. Las tendencias actuales en el desarrollo de métodos analíticos, inciden sobre todo en la etapa de preparación de muestra, mejorando los procedimientos clásicos de forma que se facilite la extracción, purificación y preconcentración del analito en muestras complejas, como las muestras biológicas, buscando otras alternativas metodológicas, que minimicen la manipulación, el contacto con los analitos, que empleen volúmenes menores de disolventes y menores tiempos de análisis, reduciendo costes y residuos que presentan una toxicidad considerable y que pueden provocar impactos importantes para el medio ambiente. En otra de las estrategias desarrolladas en esta investigación, se ha sintetizado un polímero de impronta molecular utilizando como plantilla el ácido 4-hidroxifenilacético y 4 vinilpiridina como monómero, para la extracción selectiva de seis catabolitos hidroxilados de los flavan-3-oles, antes del análisis por HPLC/DAD-MS. El método ha sido validado en un intervalo de concentraciones de 0,25 – 40 mg/L, con R2> 0,995. En optimas condiciones las recuperaciones han sido del 94% con RSD de 1,2%. El LOD y LOQ fueron de 1,22 mg/L y 3,69 mg/L respectivamente. En nuestro conocimiento, el procedimiento propuesto es la primera vez que se aplica en el análisis de los catabolitos urinarios de polifenoles. Técnicas electroquímicas. Los excelentes resultados obtenidos en la extracción selectiva y preconcentración de los catabolitos de los flavan-3-oles mediante un procedimiento MISPE, ha permitido el desarrollo de un sensor electroquímico utilizando un electrodo comercial desechable. El método no sólo detecta el biomarcador de interés, también puede cuantificar otros analitos análogos presentes en la orina, pudiendo mostrar el perfil de los catabolitos de los flavan-3-oles electroactivos y cuantificarlos. El método se ha validado en un intervalo de concentración de 10 a 200 mg/L con R2>0,999. En optimas condiciones, la recuperación fue del 94% con RSD del 8%, LOD y LOQ de 2,38 mg/L y 7,21 mg/L, respectivamente. El sensor desarrollado tiene un bajo coste y fácil uso, además es rápido y preciso, mostrando alta sensibilidad, reproducibilidad y linealidad. Además ofrece otras ventajas como la facilidad de miniaturización para los análisis in situ, los pequeños volúmenes de muestra requeridos, o los bajos volúmenes de disolventes orgánicos utilizados. En esta tesis doctoral se han propuesto tres distintas estrategias para la detección y cuantificación de ácidos fenólicos (biomarcadores de la ingesta de flavonoides): un sensor electroquímico desechable; un tratamiento de muestra pionero, basado en un procedimiento MISPE para la extracción selectiva de catabolitos urinarios de compuestos polifenolicos; y una novedosa metodología (técnica quimiométrica), basada en el análisis matemático de las matrices de datos, proporcionados por los distintos espectros de excitación-emisión de fluorescencia.